TRE promoter 구조와 원리 (Tet-on, Tet-off) doxycycline (tetracycline) inducible gene expression system
안녕하세요, 오늘은 유전자 발현을 조절하는 프로모터, 그 중에서도 유도성 프로모터 (inducible promoter) 중 하나인 TRE promoter (doxycycline inducible/repressible promoter)에 대해 알아보겠습니다.
시작에 앞서 간단한 용어 정리
- tetracycline (tet): 항생제, 테트라사이클린
- doxycycline (dox): tetracycline 유사화합물 (tet 대신 사용)
- TetR (tet repressor protein): 단백질, TetO에 결합
- TetO (tet operator): DNA서열, TetR이 결합할 수 있는 자리
- TRE (tetracycline response element): DNA 서열, 반복되는 TetO와 minimal promoter로 구성
- Tet inducible promoter = TRE promoter = TRE3G promoter = Tet3G promoter
1. 프로모터
프로모터(promoter)는 쉽게 말해 생물의 유전자를 발현시키기 위한 특수한 염기서열을 지칭하는 말입니다. 생물의 유전자 발현은 DNA를 RNA로 전사(transcription)하고 RNA를 protein으로 번역(translation)하는 과정을 통해 이루어집니다. 프로모터는 이 과정 중 DNA를 RNA로 전사하도록 지시하는 역할을 합니다.
전사의 개시와 활성 조절은 생물 내에서 특정한 신호에 의해 전사 인자(transcription factor)가 프로모터에 결합함으로써 이루어집니다. 이 때 프로모터에 결합하는 전사 인자가 전사를 활성화(activation)할 것인지 억제(repression)할 것인지 결정하며, 그 역할에 따라 전사 인자를 활성인자(activator) 또는 억제인자(repressor)라고 구분하여 지칭합니다.
프로모터는 이러한 전사 인자가 결합할 수 있는 특정 염기 서열의 집합으로, 서로 다른 전사 인자와 결합할 수 있는 다수의 motif를 가지고 있습니다. 프로모터가 가지고 있는 motif의 차이로 결합할 수 있는 전사 인자의 종류가 달라지게 되고, 결과적으로 세포 내에서 발생하는 다양한 생리 현상에 대해 서로 다른 유전자 발현 조절(gene expression regulation)을 보일 수 있는 것이죠.
2. 프로모터의 구분
프로모터는 유전자 발현 조절 기전에 따라 크게 세 가지로 구분됩니다.
- Constitutive promoter (상시 발현 프로모터): 세포의 상태와 관계 없이 지속적으로 유전자를 발현
- Conditional promoter (조건부 발현 프로모터): 세포의 상태 (화학물질의 처리, 약물의 처리, pH의 변화 등)에 따라 유전자의 발현을 조절
- Tissue/cell specific promoter (조직 특이적 발현 프로모터): 특정 조직(세포)에서만 유전자가 발현되도록 함
2.1 Constitutive promoter
유전자의 발현이 항상 유지되어야 하는 경우 해당 유전자의 발현은 constitutive promoter에 의해 조절되며 세포가 처한 상황에 관계없이 항상 높은 발현도를 유지합니다. 이 그룹에 속하는 프로모터는 다음과 같습니다. 이러한 프로모터를 이용하면 유전자가 세포에서 항시 발현하도록 만들 수 있습니다.
- EF1a promoter
- PGK promoter
- CAG promoter
- CMV promoter
- β actin promoter
- Ubc promoter 등
사실 대체로 높게 유지되는 것일 뿐 같은 프로모터라도 세포에 따라 발현도의 차이도 크게 나타나고 CMV promoter의 경우 promoter silencing이 문제가 되기도 한다. 본인이 사용할 세포의 특성에 맞춰 프로모터를 선택하는 것이 중요하다
2.2 Conditional promoter
몇몇 유전자는 특정한 신호에 의해 활성화 또는 억제되도록 조절되어야 하는데 이러한 경우 conditional promoter에 의해 발현이 조절됩니다. 예를 들어 사람이 술(에탄올)을 섭취했을 때 에탄올 분해효소가 분비되는 현상, 항생제에 노출된 박테리아가 항생제 저항성 유전자를 발현하는 현상 등이 이러한 conditional promoter의 조절에 의해 일어나는 것입니다. 가장 널리 알려지고 사용되고 있는 conditional promoter는 오늘 소개할 TRE promoter가 있습니다.
- TRE promoter: tetracycline response element promoter. Tetracycline 또는 doxycycline의 투여에 의해 유도(inducible) 또는 억제(repressible) 가능한 유전자 발현 시스템을 구축하는데 사용
- EtOH inducible promoter: enthanol에 의해 발현이 유도되는 프로모터. 종종 사용되지만 많은 단점 때문에 TRE promoter에 비해서는 대중적이지 않다
참고로 conditional gene expression system이라는 범주에서는 다양한 시스템이 존재한다. Estrogen 또는 4-hydroxy tamoxifen (4-OHT) inducible system인 ERT-Cre는 프로모터가 아닌 단백질 구조 변화에 의해 단백질의 활성이 조절되는 원리이며, Cre recombinase를 활용한 loxP-stop-loxP (LSL), gene inversion은 비가역적이긴 하지만DNA 재배열(rearrangement)을 활용해 조건부로 유전자를 발현하게 만들 수 있다. 그 외에도 소분자에 의한 단백질 결합을 이용하는 chemically induced dimerization system (CID, 예를 들어 rapamycin에 의한 FKBP와 FRB의 결합, gibberellin에 의한 GID와 GAI의 결합) 등 유전자의 조건부 발현을 위한 수단은 생각보다 훨씬 다양하다. 이러한 시스템들에 대해서는 추후 별도 포스팅으로 다루도록 하겠다
2.3 Tissue/cell specific promoter
특정 세포에서만 발현하는 유전자는 조직/세포특이적 프로모터에 의해 발현이 조절됩니다. 예를 들어 신경세포가 발현하는 SYN1 유전자, 혈액줄기세포가 발현하는 CD34, CD45 유전자, 장관줄기세포가 발현하는 Lgr5 유전자 등의 프로모터는 해당 세포에서만 전사활성을 가지고 있는 것입니다. 이러한 tissue/cell specific promoter는 특정 세포에서만 유전자가 발현하도록 설계할 때 사용합니다.
3. TRE promoter의 개발
TRE promoter는 tetracycline response element (TRE)라는 서열이 반복되어 있는 구조로 이루어져 있습니다. 이 서열은 대장균의 tetracycline resistance operon에서 처음 밝혀졌는데, Tetracycline 저항성 유전자 Tn10을 발현시키는 서열로서 tet operator (TetO)라고 명명되었습니다. 그리고 이 서열에 결합하는 전사 인자는 Tet repressor protein (TetR)으로, TetR의 결합 또는 해리에 의해 유전자의 발현이 조절되는 구조입니다.
- 대장균에서는 평소 TetR 단백질이 TetO 서열에 결합되어 Tn10의 발현을 억제하고 있다가
- 대장균이 항생물질인 tetracycline에 노출되면 TetR이 tetracycline과 결합
- TetR의 단백질 구조가 변화하여 TetO와 해리, Tn10을 발현할 수 있게 합니다
이 발현 시스템을 눈여겨본 과학자가 Manfred Gossen and Hermann Bujard 입니다. 1992년 PNAS (https://doi.org/10.1073/pnas.89.12.5547), 1995년 Science지 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7792603/)에 투고된 논문에서 이들은 박테리아의 tetracycline inducible gene expression system을 포유세포 (mammalian cell)에서 조건부 유전자 발현시스템으로 응용할 수 있다는 가능성을 보여주었습니다.
이들은 tetracycline resistance operon에서 TetO 서열과 minimal promoter (CMV promoter의 upstream sequence)를 결합하여 TRE promoter의 초기 형태를 제작하고, TetO 서열과 결합하는 성질을 가진 TetR 단백질에 전사 촉진 인자 (transcriptional activator) 중 하나인 VP16 단백질을 결합하여 tTA (tetracycline inducible transactivator)와 rtTA (reverse tetracycline inducible transactivator)를 만들었습니다. 이러한 시스템은 서로 다른 방식으로 유전자의 발현을 억제 또는 활성화할 수 있어 Tet-on 또는 Tet-off 시스템이라 명명되었고 이 명칭이 오늘날까지 그대로 사용되고 있습니다.
tTA를 구성하는 TetR과 VP16 activation domain의 서열은 아래와 같습니다.
tTA는 full length의 TetR에 VP16 activation domain이 결합되어 있는 형태입니다.
rtTA는 tTA에 특정 mutation을 도입하여 제작되었습니다 (자세한 내용은 링크의 논문 참고 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7792603/).
tTA (621bp, 207a.a.)
Ctgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaacttaaatgtgaaagtgggtcc
VP16 activation domain (387bp, 128a.a.)
Acgtacagccgcgcgcgtacgaaaaacaattacgggtctaccatcgagggcctgctcgatctcccggacgacgacgcccccgaagaggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggacacacgcgcagactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag
4. Tet-on system과 Tet-off system
위의 설명처럼 TRE promoter는 tTA 또는 rtTA가 결합할 수 있는 염기서열로 이들의 결합 또는 해리에 의해 유전자의 발현을 조절할 수 있게 해줍니다. 그 방식에 따라 Tetracycline 또는 doxycycline을 처리했을 때 유전자의 발현이 증가하는 Tet-on system과 발현이 감소하는 Tet-off system으로 나뉘어지게 됩니다.
이 두 시스템은 완전히 동일한 TRE프로모터를 사용하며, tTA와 rtTA가 모두 ‘activator’인 만큼 Tet-on system과 Tet-off system 사이에는 transactivator의 결합패턴 차이만 있을 뿐 근본적인 작동 원리는 완전히 동일합니다.
4.1 Tet-off system
Tet-off system은 tTA에 의해 작동합니다. tTA는 tetracycline이 존재하지 않는 상황에서 TRE promoter에 결합합니다. 따라서 tetracycline이 존재하지 않는 상황에서 유전자가 발현되고, tetracycline의 처리에 의해 유전자의 발현이 억제됩니다 (Tet 처리시 turn off).
4.2 Tet-on system
Tet-on system은 rtTA에 의해 작동합니다. ‘reverse’라는 이름에서 예상되듯 tTA와 반대의 패턴으로 결합합니다. rtTA는 tetracycline이 존재하지 않는 상황에서 TRE promoter와 해리된 상태로 존재하고, tetracycline 처리시 TRE promoter에 결합하여 유전자의 발현을 촉발합니다 (Tet 처리시 turn on).
4.3 요약
5. 기타 참고사항
Tet-on/off system을 탑재한 stable cell line을 제작하는 경우 single cell colony 확보가 필수적인데, 세포주에 따라 ‘off’의 TRE promoter가 유전자를 발현하는 경우가 더러 있기 때문입니다. 이러한 현상을 ‘leaky expression’ 또는 ‘leakage of gene expression’ 등으로 이야기하는데 삽입된 유전자의 위치(좌위 loci) 등 다양한 원인으로 인해 발생한다고 알려져 있습니다 (U Baron and H Bujard, 10.1016/s0076-6879(00)27292-3). 이러한 leakage 문제를 개선하기 위해 tight TRE promoter가 개발되어 상용화되어 있습니다 (pTRE-Tight Vector; https://www.takara.co.kr/web01/product/productList.asp?lcode=631059, pTREtight2; https://www.addgene.org/19407/ 등).
감사합니다.
다음에 또 봐요.
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